摘要：簡(jiǎn)單的說(shuō)，PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內InVitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專(zhuān)一性的連鎖復制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復制為原來(lái)的一百億至一千億倍。根據DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類(lèi)。

　　PCR簡(jiǎn)介

　　PCR的要素

　　基本的PCR須具備

　　1.要被復制的DNA模板 Template

　　2.界定復制范圍兩端的引物Primers.

　　3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

　　4.合成的原料(四種脫氧核苷酸)及水。

　　PCR儀工作原理

　　利用升溫使DNA變性，用限制性?xún)惹忻甘笵NA雙鏈解鏈，在聚合酶的作用下使單鏈復制成雙鏈，進(jìn)而達到基因復制的目的

　　PCR的反應包括三個(gè)主要步驟

　　分 別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱(至90~95℃)變性， 將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以做為復制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60℃)附著(zhù)于模板DNA兩端。 *后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75℃)進(jìn)行引物的延長(cháng) Extension of primers及另一股的合成。

　　PCR的*早設想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年*早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。

　　PCR的實(shí)現

　　1985年美國PE-Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應。其原理類(lèi)似于DNA的體內復制

　　PCR的改進(jìn)與完善

　　Mullis*初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：

　�、貹lenow酶不耐高溫， 90℃會(huì )變性失活，每次循環(huán)都要重新加。

　�、谝�物鏈延伸反應在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的

　　DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，

　　但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì )導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成

　　一個(gè)擴增反應周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內沒(méi)能引

　　起生物醫學(xué)界的足夠重視。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較

　　高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種

　　耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來(lái)的

　　90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來(lái)的40

　　%。②在熱變性時(shí)不會(huì )被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異

　　性和擴增效率，增加了擴增長(cháng)度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也

　　大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區別，將此酶命名為T(mén)aqDNA多聚酶Taq DNA

　　Polymerase。此酶的發(fā)現使PCR廣泛的被應用。

　　PCR儀的分類(lèi)

　　普通的PCR儀

　　把一次PCR擴增只能運行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，叫傳統的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運行。主要是做簡(jiǎn)單的，對目的基因退火溫度的擴增。該儀器主要應用于科研研究，教學(xué)，醫學(xué)臨床，檢驗檢疫等機構。

　　梯度PCR儀

　　把一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常有12種溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。因為被擴增的不同DNA片段，其*適退火溫度事不同，通過(guò)設置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴增，從而一次性PCR擴增，就可以篩選出表達量高的*適退火溫度，進(jìn)行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節約成本的同時(shí)也節約了時(shí)間。主要用于科研，教學(xué)機構。梯度PCR儀，在不設置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。

　　原位PCR儀

　　用于從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀，如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，又能標出靶序列在細胞內的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過(guò)程及病理的轉變有重大的實(shí)用價(jià)值。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

　　在普通PCR儀的基礎上增加一個(gè)熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，就成了熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同，只是PCR擴增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過(guò)熒光信號采集系統實(shí)時(shí)采集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實(shí)時(shí)結果輸出。把這PCR儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(qPCR儀)。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫學(xué)臨床檢測，生物醫藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構。

　　獲得諾貝爾獎的PCR技術(shù)

　　1995年，美國科學(xué)家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎，他所取得的成就是發(fā)明了PCR技術(shù)。

　　PCR，中文譯為聚合酶鏈式反應，其實(shí)是一種DNA的快速擴增技術(shù)，其擴增效率之高就象核裂變的“鏈式反應”那樣。PCR技術(shù)通過(guò)兩個(gè)短的稱(chēng)為引物的 DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個(gè)小時(shí)內把特定的DNA量提高1000萬(wàn)倍。這種技術(shù)一問(wèn)世，立刻引起了分子生物學(xué)研究的一場(chǎng)革命，人們利用 這種轟動(dòng)全世界的技術(shù)很快就把微觀(guān)領(lǐng)域的生物學(xué)研究大大地往前推了一步�？梢赃@么說(shuō)，PCR技術(shù)使分子生物學(xué)研究一下子獲得了突破，而且隨著(zhù)PCR技術(shù)的 日趨完善，PCR在人類(lèi)社會(huì )生活中的應用也越來(lái)越廣泛。比如說(shuō)在“DNA指紋” 中我們提到，科學(xué)家們只需要一根頭發(fā)甚至一個(gè)細胞就可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實(shí)際上就要采用PCR技術(shù)，因為一個(gè)細胞中的DNA含量實(shí)在太少 了，人們根本不可能檢測到它的指紋;有了PCR技術(shù)就好辦了，通過(guò)PCR技術(shù)把這個(gè)細胞中的DNA片斷擴增1000萬(wàn)倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑒定了。 再比如，在醫院里檢驗血液中的某種*，有時(shí)*量極少(例如有的艾滋病*攜帶者)，通過(guò)傳統的檢查方法費力又費時(shí)，這時(shí)PCR技術(shù)也許就可以幫上忙。 可以先選定這種*DNA上的一段DNA，設計合適的引物DNA，然后通過(guò)PCR技術(shù)一擴增很快就可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的 話(huà)，那么就說(shuō)明血樣中帶有該種*了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時(shí)一次做近百個(gè)擴增反應，省時(shí)省力效率高。

　　PCR技術(shù)神奇就神奇在以下幾個(gè)特點(diǎn)上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個(gè)分子就可以用于擴增了;二是擴 增效率高，目的基因的量成指數形式擴增，幾個(gè)小時(shí)就擴增1000萬(wàn)倍以上�，F在PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應用于生命科學(xué)研究、食品衛生、醫療、法醫及環(huán)境監 測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術(shù)!